1 技術(shù)原理
基因克?。℅ene cloning）或分子克隆又稱為重組DNA技術(shù)，是應(yīng)用酶學(xué)方法在體外將不同來源的DNA分子通過酶切、連接等操作重組在一起，并使之在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，形成大量的子代DNA分子的過程。
2 技術(shù)優(yōu)勢
基因克隆周期短，遺傳性狀穩(wěn)定?？寺〖夹g(shù)是人類科學(xué)技術(shù)上的一大進(jìn)步，有突破性意義，目前已經(jīng)體現(xiàn)出諸多技術(shù)優(yōu)勢，在許多領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了廣泛應(yīng)用。
3 應(yīng)用領(lǐng)域
（1）發(fā)現(xiàn)新基因；（2）載體構(gòu)建；（3）基因編輯；（4）基因突變。
4 技術(shù)路線及時(shí)間周期
5 實(shí)施方案
（1）引物設(shè)計(jì)
若克隆的目的基因是已知基因，可以依據(jù)基因組序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性引物；若克隆的目的基因是未知基因，則需要參照與該基因同源性較高的其他已知基因的序列，設(shè)計(jì)多對簡并性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
（2）總RNA的提取
根據(jù)試劑盒操作說明書，利用RNA提取試劑盒提取總RNA。
（3）RNA質(zhì)量檢測
RNA純度的檢測：使用分光光度計(jì)測定OD260/OD280的值，當(dāng)其比值在1.8-2.0之間，說明提取的總RNA純度比較高，沒有蛋白質(zhì)和基因組的污染。
RNA完整性的檢測：取2 μL RNA，與2 μL溴酚藍(lán)混勻，用1%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，120 V電泳20 min后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。當(dāng)26S與18S條帶清晰，且亮度比大約是2:1，5S條帶若隱若現(xiàn)，而且沒有其它條帶時(shí)，說明完整性好，可以用于逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。
（4）逆轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcription PCR, RT-PCR）
根據(jù)試劑盒操作說明書，利用逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒進(jìn)行操作。
（5）PCR產(chǎn)物的回收
PCR反應(yīng)得到目的條帶后，根據(jù)膠回收試劑盒說明書進(jìn)行目的片段的回收。
（6）PCR產(chǎn)物的連接和轉(zhuǎn)化
按照連接試劑盒說明書進(jìn)行操作，將PCR目的片段與T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將菌液均勻涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)箱中正放1 h，待菌液被瓊脂完全吸干后，倒置平板，過夜培養(yǎng)。
（7）菌液PCR檢測
在平板上挑取5-10個(gè)白色菌落，加入含有Amp的1 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)6 h。3000 rpm離心3 min，吸掉400 μL上清液，短暫渦旋將沉淀打散，然后把菌液當(dāng)成模板，使用目的基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測是否含有目的條帶。挑選擴(kuò)增出正確目的條帶的菌液送生物公司測序。
（8）序列比對分析
將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對，以判斷是否為所需的目的片段序列。
