1、技術原理
植物基因轉化技術可分為兩大類：一類是直接基因轉移技術，包括基因槍法、原生質體法、脂質體法、花粉管通道法、電激轉化法、PEG介導轉化方法等，其中基因槍轉化法是代表。
另一類是生物介導的轉化方法，主要有農(nóng)桿菌介導和病毒介導兩種轉化方法，其中農(nóng)桿菌介導的轉化方法廣泛應用于雙子葉植物的遺傳轉化。
基因轉化-OE原理是將重組質粒轉化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中后，用含有重組質粒的農(nóng)桿菌去侵染植物葉子切口，目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物細胞的轉移和整合，然后通過組織培養(yǎng)技術，得到轉基因植物。當構建的表達載體含有高活性組成型啟動子時，目的基因就會被高活性啟動子啟動在細胞內過量表達，這就是基因轉化過量表達。
基因轉化-RNAi原理是在質?；虿《据d體中，利用RNA聚合酶啟動因子U6或T7分別控制正義鏈和反義鏈的合成并退火形成雙鏈siRNA，或在啟動子下游設計帶發(fā)夾結構的表達單位，自身退火形成雙鏈siRNA。將重組質粒轉化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中后，用含有重組質粒的農(nóng)桿菌去侵染植物葉子切口，細胞中與目標基因序列同源的雙鏈小RNA可以高效、特異性地阻斷目標基因表達，促使mRNA降解，誘使細胞表現(xiàn)出目標基因缺失的表型。在植物體中，RNAi被稱為基因共抑制，也是一種體內抵御外在感染的重要保護機制。
2、技術優(yōu)勢
1)模仿或利用天然的轉化載體系統(tǒng)，成功率高，效果好；
2)農(nóng)桿菌介導的轉化系統(tǒng)的機理研究得最清楚，方法最成熟，應用也最廣泛；
3)農(nóng)桿菌介導的轉化系統(tǒng)轉化的外源基因以單拷貝為多數(shù)，遺傳穩(wěn)定性好，并且多數(shù)符合孟德爾遺傳規(guī)律，因此轉基因植株能較好地為育種提供了中間選育材料；
4)農(nóng)桿菌介導的轉化系統(tǒng)操作比較容易，需要的儀器設備簡單，成本低，易于推廣。
3、應用領域
1)生產(chǎn)重組疫苗、抑生長素、胰島素、干擾素、人生長激素等；
2)培育了一批具有抗蟲、抗病、抗旱耐鹽、耐除草劑等性狀的轉基因作物；
3)改善作物農(nóng)藝性狀如光合效率、肥料利用效率和改善品質等。
4、技術路線及時間周期
5、實施方案
1、目的基因克隆
1)引物設計：
基因轉化-OE：我們建議客戶提供目的基因的編碼序列（Coding sequence, CDS），根據(jù)CDS序列設計可擴增完整CDS序列（無終止子）的特異性引物。因為不是所有讀碼框（ORF）都能被表達出蛋白產(chǎn)物，或者能產(chǎn)生生物學功能的蛋白。
基因轉化-RNAi：我們建議客戶一般采用200-300 bp片段插入沉默載體中，實驗采用pHellsgate8 載體。pHellsgate8 RNAi載體構建方法采用BP重組反應。根據(jù)目的基因序列與其他物種基因序列進行比對，設計RNAi載體引物A-RNAi-attB-F（含attB位點）和A-RNAi-attB-R（含attB位點）。
2)若客戶提供已測序驗證的含有目的基因的T載體，則直接進行第5)步；若客戶只提供植物材料，則進行第3)步。
3)使用本公司專門針對物種特性開發(fā)的RNA提取試劑盒進行提取樣品總RNA提取。
4)反轉錄獲得第一鏈cDNA。
5)以cDNA或含有目的基因的T載體為模板，使用特異性引物進行PCR擴增。
6)PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，并切膠回收。
7)使用DNA拓撲異構酶(DNA Topoisomerase)進行TA連接，轉化感受態(tài)細胞后對陽性克隆進行菌落PCR鑒定，鑒定為陽性的再測序驗證。
8)經(jīng)過驗證的TA質粒置于-80℃保存。
2、構建過表達載體
本公司使用ClonExpress?技術，無須中間載體，一步將目的片段定向克隆進入植物過表達載體中。詳細操作請見“載體構建”?？筛鶕?jù)客戶需求使用不同抗性（卡那霉素、潮霉素、慶大霉素、除草劑）的植物表達載體。
3、凍融法轉化農(nóng)桿菌
用凍融法將過表達載體和RNAi載體轉化到農(nóng)桿菌菌株（GV3101、LBA4404、EHA105可選）中，具體操作如下：
1)吸取5-10 μl質粒DNA加入100 μl融化后感受態(tài)細胞，上下吹吸均勻，冰上放置30 min。
2)將混合液放入液氮中1 min。
3)將混合液取出，轉入37℃水浴5 min融化后，加入650 μl新鮮LB液體培養(yǎng)基，28℃，150 rpm/min低速振蕩3 h左右。
4)8,000 rpm離心30 sec，去上清，加100 μl液體培養(yǎng)基，懸浮菌體后涂于含抗生素和利福平的LB固體培養(yǎng)基中。
5)獲得的轉化菌株用于農(nóng)桿菌侵染。
4、組培無菌苗，制備外植體
1)用75%的乙醇和20%次氯酸鈉溶液分別依次漂洗種子10 min，再用無菌水漂洗3次，每次3 min，然后放在1/2MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，當煙苗長到四片葉左右時，取嫩葉進行分化。
2)將新鮮的無菌煙草葉片剪成1 cm見方的小塊，接種于不含任何抗生素的煙草分化培養(yǎng)基上預培養(yǎng)2 d。煙草分化培養(yǎng)基為MS+2.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA, 蔗糖 30 g/L, 瓊脂6 g/L， ph=5.8;
5、農(nóng)桿菌侵染，誘導出芽
1)在取煙草外植體的同時將含有過表達質粒的農(nóng)桿菌接種于含適當濃度的抗生素和利福平的YEB培養(yǎng)基中，28℃，250 rpm/min，振蕩培養(yǎng)過夜；
2)將飽和的農(nóng)桿菌菌液按1:100的比例注入到不含任何抗生素的YEB培養(yǎng)基中，28°C，250 rpm/min，振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5左右；
3)將預培養(yǎng)兩天的煙草外植體浸到活化好的農(nóng)桿菌菌液中10 min；
4)用濾紙將外植體上的殘余菌液吸干，之后接種于不含任何抗生素的分化培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)兩天；
5)將暗培養(yǎng)過的外植體轉入篩選培養(yǎng)基上，每10 d繼代一次。
6)再生苗長到1-2CM時切下，轉入伸長培養(yǎng)基中瓶中培養(yǎng)。
6、抗性T0代植株再生
將分化出的不定芽移入生根培養(yǎng)基中生根，生根培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L NAA+ PPT 4 mg/L + Timentin 160 mg。
7、PCR檢測陽性植株
待試管苗長到3-4片時，揭開封口膜，取少量葉子提取DNA，根據(jù)載體特有序列設計引物進行PCR擴增檢測。
8、煉苗移栽（可選）
PCR檢測為陽性的植株，在光照培養(yǎng)室中煉苗3-4 d，然后移栽到培養(yǎng)缽中。
9、收獲T1代種子（可選）
加快生長周期，單株套袋，收獲種子。
6、服務內容 周期 驗收標準
目的基因克隆 3個工作日 PCR電泳圖、測序報告
植物表達載體構建 10個工作日 PCR/酶切電泳圖、測序報告
煙草遺傳轉化 約2個月 植株DNA PCR擴增目的基因電泳圖特異條帶
煉苗移栽（可選） 15個工作日 -
收獲T1代種子（可選） 加速生長周期 -
目的基因轉錄qRT-PCR檢測(可選） 10個工作日 目的基因轉錄數(shù)據(jù)
目的基因Southern blot（可選） 20個工作日 雜交電泳圖
目的基因蛋白Western blot（可選） 20個工作日 雜交電泳圖
