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實(shí)驗(yàn)簡介

本實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)以辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）標(biāo)記的細(xì)胞，采用顯色底物體系對(duì)目標(biāo)抗體或蛋白進(jìn)行定位顯示。

實(shí)驗(yàn)材料

試劑

• HRP標(biāo)記抗體孵育好的細(xì)胞
• 3% H₂O₂（過氧化氫）
• Diaminobenzidine (DAB) 四鹽酸鹽
• 0.05 M Tris緩沖液 (pH 7.6)
• 0.3% (w/v) Nickel chloride 或 Cobalt chloride 溶液
• Chloronaphthol 和 絕對(duì)乙醇
• Aminoethylcarbazole (AEC) 和 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）
• 0.1 M Sodium acetate buffer (pH 5.2)

耗材與器材

• Whatman No. 1 濾紙
• 載玻片、蓋玻片
• DPX封片劑或Gelvatol、Mowiol

操作方法

1?? DAB 顯色法

1. 將 6 mg DAB 溶解于 10 mL 0.05 M Tris緩沖液 (pH 7.6)
2. 加入 0.1 mL 3% H2O2
3. 若有沉淀，過濾
4. 將工作液加至細(xì)胞標(biāo)本上，室溫孵育 1–20 分鐘
5. 用蒸餾水終止反應(yīng)
6. 可選：復(fù)染，封片

2?? DAB + 金屬鹽增強(qiáng)顯色法

1. 將 6 mg DAB 溶于 9 mL Tris緩沖液
2. 加入 1 mL 0.3% Nickel chloride 或 Cobalt chloride
3. 再加入 0.1 mL 3% H2O2
4. 若有沉淀，過濾
5. 加至細(xì)胞標(biāo)本，室溫孵育 1–20 分鐘
6. 用蒸餾水終止反應(yīng)
7. 可選：復(fù)染，封片

3?? Chloronaphthol 顯色法

1. 將 0.3 g Chloronaphthol 溶于 10 mL 絕對(duì)乙醇，低溫保存
2. 取 100 μL 儲(chǔ)備液于 10 mL Tris緩沖液 中
3. 加入 0.1 mL 3% H2O2
4. 過濾去除沉淀
5. 將顯色液加入細(xì)胞，室溫孵育 10–40 分鐘
6. 用蒸餾水終止反應(yīng)
7. 可選：復(fù)染，封片

4?? AEC 顯色法

1. 將 1.0 mL 0.4% AEC 溶液加入 15 mL 0.1 M Sodium acetate buffer (pH 5.2)
2. 加入 0.15 mL 3% H2O2
3. 過濾
4. 顯色液加至細(xì)胞，室溫孵育 10–40 分鐘
5. 用蒸餾水終止反應(yīng)
6. 可選：復(fù)染，封片

注意事項(xiàng)

• DAB及AEC需避光操作，AEC產(chǎn)物易褪色，操作需避免氣泡
• 所有含H₂O₂溶液現(xiàn)配現(xiàn)用，使用30%母液稀釋
• 復(fù)染建議參照 Rodig 2019《Counterstaining, Mounting, and Photographing Stained Cells》
• 注意配制液體pH值及溶液保質(zhì)期

參考文獻(xiàn)

Rodig SJ. 2019. Counterstaining, Mounting, and Photographing Stained Cells. Cold Spring Harb Protoc doi:10.1101/pdb.prot099770IF: NA NA NA