患者源性腫瘤類器官（PDTO）作為可靠的臨床前模型，能夠真實反映原發(fā)腫瘤的生理學特征，在腫瘤學基礎研究、疾病建模、新藥物研發(fā)和個性化治療中具有重要意義。近期，有研究團隊通過將腫瘤組織碎片中制備獲得的中尺度膠原束與明膠相結合，制備了一種新型的仿生水凝膠（新型-gel），用于培養(yǎng)來自患者的腫瘤類器官。研究指出，新型-gel中培養(yǎng)的肺癌類器官（LCOs）相較于無中尺度膠原束的Con-gel，在直徑、細胞活性和形態(tài)上顯示顯著提升，更貼近體內腫瘤的特征。此外，這些LCOs在新型-gel中保持了與原始腫瘤組織類似的組織學特征、突變譜、基因表達和藥物反應，展示出廣泛的應用潛力，有助于推動個性化醫(yī)療和定制治療策略的發(fā)展。
創(chuàng)新點
復合水凝膠（新型-gel）的制備和表征。
新型-gel 支持患者來源的腫瘤類器官的活力和生長。
新型-gel 有效地再現了肺癌類器官中親本腫瘤觀察到的組織學和突變特征。
使用 新型-gel 培養(yǎng)的肺癌類器官仍保持了藥物敏感性和長期培養(yǎng)能力
為了在體外模擬中等尺度膠原結構細胞外基質，作者利用腫瘤源性的細胞外基質(ECM)碎片制備獲得中等尺度膠原束（新型B）。這些膠原束平均長度為90 ± 27 μm，平均直徑為5 ± 1.5 μm。ECM碎片經過-80°C三次凍融去細胞化處理，有效去除了組織中殘留的腫瘤細胞。在解凍后，利用高通量組織細胞粉碎機快速機械破碎誘導形成中等尺度的膠原束(圖1)。
圖1 中等微觀尺度的復合水凝膠制備
為了探索具有中等尺度膠原結構的仿生水凝膠在增強來源于原發(fā)性肺癌細胞的肺癌類器官（LCOs）生長和遷移方面的能力，作者培養(yǎng)了18個LCOs，這些細胞直接來自原發(fā)性肺癌組織。在新型-gel中培養(yǎng)的LCOs呈現不規(guī)則的形態(tài)，與體內觀察到的腫瘤特征一致，而對照組則顯示為球狀類器官。同時，選擇將傳統(tǒng)Matrigel和添加明膠的納米級膠原（Nano-gel）作為對照組。結果表明，在新型-gel中的LCOs與Matrigel和Nano-gel中的相比，細胞數量更多，直徑更大。此外，作者從肉瘤和甲狀腺癌樣本中獲得了中等尺度膠原束，這兩種類型的腫瘤類器官在新型-gel中得到了有效復現(圖2)。
圖2 新型-gel促進了患者源性LCOs的生長和繁殖
在新型-gel中培養(yǎng)的LCOs能夠準確復制其母體癌組織的組織學特征至關重要。研究采用H&E染色和免疫熒光染色技術比較了在新型-gel中培養(yǎng)的LCOs與其母體肺癌組織的形態(tài)和分子特征。從肺腺癌細胞中衍生的LCO-4顯示腺泡或大腺體結構，類似于其母體癌組織的結構，而在新型-gel中培養(yǎng)的LCO-4顯示了與肺腺癌相關的分子標記物表達，包括napsin-A、甲狀腺轉錄因子1、細胞角蛋白7以及細胞增殖標記Ki67，結果表明這種分子模式與其母體肺癌組織高度一致。綜合表明，在新型-gel中培養(yǎng)的腫瘤類器官能夠精確復制其母體腫瘤的組織學特征(圖3)。
圖3 新型-gel水凝膠培養(yǎng)的LCOs再現了親代腫瘤的組織病理特征
新型-gel水凝膠中培養(yǎng)的LCOs保留了原始腫瘤的遺傳學譜。通過WES分析4對原發(fā)性肺癌組織及其在Con-gel和新型-gel中的匹配LCOs，驗證它們保留了母體腫瘤的遺傳突變。LC組織與其相應LCOs表現出83.3%至97%的高一致性。新型-gel中的LCOs的變異等位基因頻率（VAF）分布與原始LC組織非常相似。在Con-gel和新型-gel中培養(yǎng)的LCOs保留了TP53、BCLAF1等驅動突變，以及USP8、KEAP1等癌變基因的遺傳變化。LC組織與相應LCOs之間的基本體細胞突變模式得以良好保留，主要堿基替換類型包括C > T/G（Ti）和C > A/G > T轉換（Tv），與肺癌突變譜一致。進一步RNA測序分析顯示，新型-gel和Con-gel中培養(yǎng)的LCOs的基因表達譜高度一致，整體基因表達相關性超過0.948。PCA結果顯示新型-gel中培養(yǎng)的LCOs能有效地保留其在Con-gel中觀察到的RNA表達特性(圖4)。
圖4 新型-gel水凝膠培養(yǎng)的LCOs保留了原始組織的遺傳特征
新型-gel培養(yǎng)的LCOs保持藥物敏感性。作者評估了在新型-gel中培養(yǎng)的六種LCOs對肺癌常用藥物（阿霉素、順鉑、厄洛替尼和紫杉醇）的藥物敏感性。培養(yǎng)7至10天后，LCOs經過3至5天的藥物處理，然后評估其細胞存活率。結果顯示，不論是在Con-gel還是新型-gel中培養(yǎng)的LCOs都展示出一致的藥物反應模式，表明中尺度膠原束并未顯著改變化療藥物的敏感性。然而，不同患者來源的LCOs在Con-gel和新型-gel中對四種化療藥物的反應差異顯著。例如，LCO-1對所有藥物均無敏感性，而LCO-2對阿霉素和厄洛替尼敏感，但對順鉑和紫杉醇表現出耐藥性(圖5)。這些結果強調了進行快速的體外藥物敏感性測試以優(yōu)化個體化化療方案的重要性。
圖5 conc -gel和新型-gel中培養(yǎng)類器官的藥物測試
與傳統(tǒng)的 M-gel比較：
新型-gel 通過使用直接來自患者的膠原束成分，提供了一種更加個性化的方法，與來自 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤細胞的 Matrigel 相比 ，這表明 新型-gel 更適合個性化患者治療。此外，MC-gel 的楊氏模量為 12.56 ± 2.7 kPa ，與肺腫瘤組織的楊氏模量 (12.73 kPa) 非常接近，而 Matrigel 的楊氏模量通常約為 1.29 kPa 。此外，新型-gel 旨在復制腫瘤細胞外基質復雜的膠原結構，這對調節(jié)細胞表型、機械轉導、生長因子通訊、長距離細胞間相互作用和癌細胞浸潤有顯著影響。
文章信息：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.04.035
方法：
1.中尺度膠原束制備
用冷 PBS 將腫瘤樣本清洗兩次，然后切成 1-2.5 mm3用剪刀將組織切成碎片。隨后將切碎的組織與 5 ml 膠原酶Ⅰ（3 mg/ml）和 ROCK 抑制劑 Y-27632 二鹽酸鹽（10 μM）一起在 15 ml 離心管中孵育 1.5 h，使用恒溫培養(yǎng)振蕩器（WS20，上海）設定轉速為 50 rpm，維持在 37 °C，直到觀察到大量絮狀沉淀和細胞懸浮液。消化后，將組織樣本通過細胞過濾器（70 μM）以從單細胞懸浮液中分離出大的未消化的簇。隨后將大的未消化的簇在 ?80 °C 和室溫下進行多次凍融循環(huán)以消除剩余的細胞。隨后，使用組織研磨機（Fish Scientific）以 6.5 m/s 的速度在 4 °C 下將剩余的纖維均質化。均質化過程包括搖動 1 分鐘，然后保持 1 分鐘，總共重復 7 個循環(huán)。這導致生成中等大小的膠原束，長度約為 90 ± 27 μm，平均直徑為 3.5 至 6.5 μm。隨后將中等大小的膠原纖維浸泡在 75% 酒精中 1 小時，使其滅菌并失活，然后用無菌去離子水徹底清洗（4-5 次）以保存。將中等大小的膠原纖維浸泡在75%酒精中1小時進行滅菌和滅活，然后用無菌去離子水徹底清洗（4-5次）以供保存。將中等大小的膠原纖維浸泡在75%酒精中1小時進行滅菌和滅活，然后用無菌去離子水徹底清洗（4-5次）以供保存。
2.彈性模量測量
根據制造商的說明，使用位移控制的 PIUMA 納米壓痕儀（Optics11，荷蘭阿姆斯特丹）進行納米壓痕測試。簡而言之，使用 Pattex 膠將具有不同濃度中尺度膠原蛋白束的 mTGase 交聯明膠固定在玻璃底盤上。球形尖端半徑為 50 μm ( k = 0.5 N/m) 用于樣品測試。在每組實驗之前，通過在固體表面施加壓力并建立懸臂彎曲和探針位移之間的等效性來校準懸臂彎曲。校準后，將裝有樣品的盤子放在 PIUMA 樣品臺上。樣品在室溫下浸入 PBS 中，確保納米壓痕儀尖端在整個過程中保持在溶液表面以下，以防止由空氣-水界面的強粘附力引起的誤差。每個樣品的應力測試進行 5-6 次，確保測量之間的最小距離為 200 μm。每個樣品的有效楊氏模量是通過多次測量計算出來的。每組至少進行四次獨立測試以進行量化。
3. 流變測量
采用美國TA Instruments公司的HR20旋轉流變儀對材料進行流變性能評價，該設備具有精密設計的直徑20 mm測試平臺，間隙尺寸為500 μm。在允許180 s的熱平衡時間后，在整個實驗過程中，系統(tǒng)溫度恒定為25 ℃。應變掃描實驗中施加的應變從0.1 %變化到100 %。在頻率掃描實驗中，在頻率從0.1 %變化到100 %時，保持1 %的恒定應變值。最后，在應力松弛實驗中，采用2 %的固定應變設置，總測試時間為600 s。
4.. 掃描電子顯微鏡（SEM）
制備新型凝膠和 Con 凝膠，并在液氮中速凍 10 分鐘。隨后，在 2 Pa 的壓力下對它們進行 24 小時的冷凍干燥，以保持其多孔結構的完整性。使用手術刀小心地切割冷凍干燥的樣品，并將其固定在鋁制支架上。隨后，通過濺射涂層將一層金涂在樣品上，然后用 SEM（HITACHI，Regulus 8100）對其多孔形態(tài)進行成像，加速電壓為 20 kV，初始放大倍數為 100 倍。對于孔徑測量，每組量化了超過 100 個孔。
5. 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）
使用VERTEX70紅外光譜儀（德國布魯克）在反射ATR模式下對凍干水凝膠樣品進行傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析，光譜范圍為400~4000cm ?1，從而獲取有關化學官能團組成的微觀信息。
6.膨脹系數
準確稱量新型凝膠和 Con 凝膠，然后在室溫下浸泡在過量蒸餾水中，孵育時間為 0、2、6、12 和 24 小時。然后，用鑷子小心地取出膨脹的水凝膠，用濾紙輕輕擦拭以消除任何表面水分，然后重新稱重。重復該過程，直到達到一致的重量。膨脹率是通過使用提供的公式計算三個值的平均值來確定的。膨脹率 = (Wb - Wa)/Wa × 100 %。其中，Wb 表示濕支架的重量，而 Wa 表示干支架的重量。
7.類器官培養(yǎng)
將按照“中尺度膠原束制備”部分所述方法獲得的細胞懸浮液以 1000 g 離心 5 分鐘，然后用 PBS 清洗，再以 1000 g離心 5 分鐘。最后，將腫瘤細胞重新懸浮在濃度為 4% 的明膠溶液中。將 10 滴由 新型 凝膠（約 20 μL）和細胞（約 20,000 個細胞/滴）組成的混合物滴入六孔板的每個孔中。將它們小心地放入 37 °C 的環(huán)境中，在 5% 的 CO2 濃度下進行進一步孵育。凝固后，每個孔添加肺癌類器官培養(yǎng)基（2 毫升）。
8.H&E 染色和 IF 分析
將新鮮的肺腫瘤組織首先浸泡在10％福爾馬林溶液中24至48小時，然后轉移到70％乙醇溶液中進一步保存，再包埋在石蠟中。在新型-gel和Con-gel中培養(yǎng)的類器官浸泡在4％福爾馬林溶液中24-48小時，然后用70％乙醇溶液中的伊紅處理，再包埋在瓊脂糖（2％）中，進行后續(xù)處理，包括H&E染色和免疫熒光（IF）分析。將包埋在石蠟中的腫瘤組織和類器官切成厚度約為4μm的切片，并在60°C的溫度下干燥過夜。對于免疫熒光實驗，使用檸檬酸溶液（pH 6）對石蠟載玻片進行抗原修復。) 脫蠟和復水后。使用一抗 Napsin A (ABclonal, A5594)、細胞角蛋白 5/6 (CK5/6) (Proteintech, 28506-1-AP)、TP63 (Proteintech, 12143-1-AP)、TTF-1 (ABclonal, A18128)、細胞角蛋白 7 (CK7, Proteintech, 17513-1-AP)、Ki67 (Proteintech, 27309-1-AP) 對制備的組織切片進行適當的抗體染色。然后用 PBS 沖洗載玻片，并在 25 °C 下與稀釋的二抗一起孵育 1 小時。用 DAPI 標記細胞核。隨后，使用 Leica 制造的共聚焦顯微鏡 (LSM900) 掃描和捕獲載玻片。TTF-1 (ABclonal，A18128)、細胞角蛋白 7 (CK7，Proteintech，17513-1-AP)、Ki67 (Proteintech，27309-1-AP)。然后用 PBS 沖洗載玻片，并在 25°C 下與稀釋的二抗孵育 1 小時。用 DAPI 標記細胞核。隨后，使用 Leica 制造的共聚焦顯微鏡 (LSM900) 掃描和捕獲載玻片。TTF-1 (ABclonal，A18128)、細胞角蛋白 7 (CK7，Proteintech，17513-1-AP)、Ki67 (Proteintech，27309-1-AP)。然后用 PBS 沖洗載玻片，并在 25°C 下與稀釋的二抗孵育 1 小時。用 DAPI 標記細胞核。隨后，使用 Leica 制造的共聚焦顯微鏡 (LSM900) 掃描和捕獲載玻片。
9. DNA提取及全外顯子組測序（WES）分析
使用 QIAamp DNA FFPE 組織試劑盒 (QIAGEN, 56404) 提取總 DNA，然后使用 Covaris M220 聚焦超聲波破碎儀進行碎裂，隨后進行測序文庫構建準備。根據供應商提供的制造商協議，使用 Human Exome 2.0 Plus 試劑盒 (Twist Bioscience) 進行外顯子組捕獲。在 LC-Bio Technology Co., Ltd (中國杭州) 使用 Illumina NovaSeq 6000 測序系統(tǒng) (Illumina) 對最終文庫進行雙端 150 bp 測序。比對之前，使用 fastp 軟件消除包含測序接頭或具有 q 質量20 的核苷酸的低質量讀取。為了比對目的，我們使用了 BWA (Burrows Wheeler Aligner) 將讀取與 hg19 參考基因組對齊。比對后處理包括使用 Broad Institute 存儲庫網站上的 Picard 工具識別和標記重復讀取。此外，還進行了第二次比對后處理步驟，通過實施局部讀取重新比對來解決插入/缺失附近的潛在比對錯誤。為了在變異調用之前減輕系統(tǒng)性偏差，對堿基質量分數進行了重新校準。通過結合使用 Mutect2 算法檢測體細胞 SNV 和 InDel，而 ANNOVAR 將生物學信息納入變異集。使用 CNVkit 軟件工具集檢測拷貝數變異 。根據序列的GC含量對讀取分布進行標準化，有助于計算腫瘤和正常樣本之間的拷貝數差異。
10. RNA測序
按照制造商的指導，使用 Trizol 試劑 (thermofisher, 15596018) 提取總 RNA。隨后，我們使用 Bioanalyzer 2100 Nano LabChip Kit (Agilent, 5067-1511) 評估分離 RNA 的數量和純度。為了構建測序文庫，僅使用 RIN 數超過 70 的高質量 RNA 樣本。為了從 5ug 總 RNA 中分離 mRNA，使用 Dynabeads Oligo (dT) (Thermo Fisher, 61005) 進行了兩個純化循環(huán)。隨后使用二價陽離子 (NEB, e6150) 在 94 °C 下對純化的 mRNA 進行 5-7 分鐘的片段化。使用 SuperScript? II 逆轉錄酶 (Invitrogen, 1896649) 通過 cDNA 合成將片段化的 RNA 轉化為互補 DNA。接下來，DNA聚合酶I（NEB，m0209），RNase H（NEB，m0297），我們利用 R 進行相關性分析，通過新型-gel 和 Con-gel 中類器官平行實驗的相關性來評估實驗結果的可靠性和操作穩(wěn)定性。為了評估樣品之間的一致性，我們計算了 新型-gel 和 Con-gel 中四對類器官之間的 Pearson 相關系數。相關系數越高，表示在這些平行實驗中觀察到的可重復性程度越高。對于本研究，我們使用 R 中的 princomp 函數進行主成分分析 (PCA)。
11.體外藥物研究
用于在實驗室環(huán)境中進行藥物測試的化合物，從 MedChemExpress 獲得，并根據提供的指南溶解在二甲基亞砜 (DMSO) 或 PBS 中。將類器官解離成單個細胞、定量，然后接種在黑色 96 孔板中，每個孔有三個重復，每個孔包含 10,000 個細胞。這些培養(yǎng)皿孵育 7-10 天的生長期。隨后將類器官暴露于 10 μmol/L 藥物濃度中 3-5 天。之后，按照制造商提供的說明，使用 CellTiter-Lumi? 發(fā)光檢測試劑盒評估三維 (3D) 細胞 (Beyotime, C0061S) 的活力，從而評估細胞活力。為了在數據分析過程中標準化不同板之間的差異，我們計算了對照百分比。僅用 DMSO 處理的孔中獲得的信號作為我們的陰性對照，設置為 0%，而每個單獨的板上未經任何藥物處理的孔則被指定為 100%。相對細胞存活率是根據三個生物學重復來確定的。
1. 3D 細胞/類器官培養(yǎng)水凝膠的替代
Kemigel?——自組裝短肽水凝膠
Kemigel?是北京密碼子生物公司提供的合成肽水凝膠,具有可調節(jié)的剛度和功能，可模擬不同組織的細胞外基質，并且沒有批次間的差異，讓您每次都有信心獲得可靠和一致的結果。 Kemigel?的水凝膠具有固有的生物相容性和可生物降解性，為您提供將研究轉化為臨床并提供改變生活的療法的潛力。
自組裝短肽技術最初源自于Zhang院士(世界著名科學家、奧地利科學院、美國麻省理工學院)，自組裝短肽技術已經發(fā)表過＞10000+論文，其中關于細胞三維培養(yǎng)＞500篇，類器官培養(yǎng)的＞100篇。我們團隊在國際國內較高水平學術刊物上發(fā)表論文如包括Biomaterials，CR，NPJ等以一作或者通訊作者發(fā)表的代表性的5篇SCI英文文章2021年統(tǒng)計總影響因子暫為>152.5，其中單篇現在的最高影響因子為～72.0。
Kemigel? 自組裝短肽的特點
1）化學合成純度可控，批次穩(wěn)定；
2）生物相容性較好；
3）自組裝動態(tài)過程,利用非共價鍵；
4）支架具有納米級的結構層次；
5）結構較單一，雜質控制在有限的價格區(qū)間，其成分易控制；
6）不來源于動物，免疫原性小；
7）不會帶傳染病毒或疾病等，或者可能性極??；
8）降解成為氨基酸殘基；
9）提供仿生的生長環(huán)境，基本可模擬體內的真實環(huán)境；
10）可以單獨使用，也可組合使用
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